Ihre Ausbildung hat sie an der berühmten Schauspielschule "Florent" genossen und spielt seither sowohl in Filmproduktionen als auch auf dem Theater. Große Aufmerksamkeit bei Kritik und Publikum erzielte Mathilde Seigner 1999 mit "Schöne Venus". Dieser Film brachte ihr direkt die Nominierung als beste Nebendarstellerin für den César.
Seither war sie in weiteren erfolgreichen Produktionen wie z.B. "Die wiedergefundene Zeit" (1999) und "Harry meint es gut mit dir" (2000) zu sehen. Mit einem der Großen der französischen Schauspielkunst, dem Kultstar Michel Serrault, konnte Mathilde Seigner in "Eine Schwalbe macht den Sommer" (2000) zusammenarbeiten.
Weitere Filme mit Mathilde Seigner: "Der Mann meines Herzens", "Sex, Lügen und Intrigen" (beide 1996), "Eine saubere Affäre" (1997), "Meine schöne Schwiegermutter" (1998), "Das Zimmer der Zauberinnen", "Hometown Blue" (beide 1999), "Milch der Zärtlichkeit", "Betty Fisher et autres histoires", "Inch'Allah dimanche" (alle 2001), "Madame Sans-Gêne" (2002),"Tristan" (2003), "Eine französische Hochzeit" , "Le genre humain - 1ère partie: Les parisiens" (beide 2004), "Tout pour plaire", "Le courage d'aimer", "Palais royal!", "Zone libre" (alle 2005), "Camping", "Le passager de l'été" (beide 2006), "Danse avec lui", "3 amis", "Détrompez-vous", "Freie Zone" (alle 2007), "Camping 2", "Une semaine sur deux (et la moitié des vacances scolaires)", "Trésor" (alle 2009), "Willkommen in der Bretagne" (2011), "Der Krieg der Knöpfe" (2012).