Ihre ersten Filmerfahrungen sammelte sie 1983 unter der Regie von Martin Scorsese in "The King of Comedy". Ihre kleine Rolle fiel jedoch der Schere zum Opfer. Im selben Jahr gab sie dann in "Scarface" als Al Pacinos Schwester ihr "offizielles" Filmdebüt. 1986 spielte sie wieder unter Scorseses Regie, diesmal neben Paul Newman als manipulative Freundin von Tom Cruise in "Die Farbe des Geldes", wofür sie in der Kategorie Beste Nebendarstellerin für den Oscar nominiert wurde.
1989 war sie in James Camerons Unterwasserthriller "Abyss - Abgrund des Todes" zu sehen. Und besonders auffällig war sie als hübsche und emanzipierte Maid Marian neben Kevin Costner im Superhit "Robin Hood - König der Diebe" (1991). Mary Elizabeth Mastrantonio ist seit 1990 mit dem Regisseur Pat O'Connor verheiratet, mit dem sie auch in "Im Zeichen der Jungfrau" (1988) und "Narren des Schicksals" (1990) zusammenarbeitete, abwechselnd in New York und London. Sie haben zwei gemeinsame Söhne.
Weitere Filme mit Mary Elizabeth Mastrantonio: "Slam Dance" (1987, Regie: Wayne Wang), "Das Gesetz der Macht" (1991, Regie: Michael Apted, Mit Gene Hackman), "Uncle Vanya" (1991, TV-Produktion)"White Sands" (1992, Regie: Roger Donaldson, mit Mickey Rourke und Willem Dafoe), "Gewagtes Spiel" (1992, R: Michael Apted, mit Kevin Kline, Kevin Spacey und Rebecca DeMornay), "25 Cents" (1994, Regie: James Foley, wieder mit Al Pacino), "Das Geheimnis der drei Wünsche" (1995, Regie: Martha Coolidge, mit Patrick Swayze und Diane Venora), "Wenn sich der Nebel lichtet - Limbo" (1999), "My Life So Far" (1999), "Zeugenschutzprogramm" (1999), "Der Sturm" (2000), "(2001), "Gefährliche Enthüllungen" (2001), "Standing Room Only", "The Brooke Ellison Story" (beide 2004), "Without a Trace" (Serie, neun Folgen, 2005/2006), "Stories of Lost Souls" (2006), "The Russell Girl" (TV, 2008), "Grimm" (Serie, 2012).