Für seine Darstellung des mittellosen Terry Prescott in Kenneth Lonergans Regiedebüt "You Can Count on Me" erhielt er 2000 von allen Seiten große Anerkennung: Mark Ruffalo. Zu seinen vielen Filmauszeichnungen, darunter der Grand Jury Prize des Sundance Film Festivals 2000, gehören der Best Actor Award des Montreal Film Festivals sowie der New Generation Award der Los Angeles Film Critics Association. Seine Filmarbeit brachte ihm auch eine Nominierung als beste männliche Hauptrolle für den Spirit Award ein.
Erste Aufmerksamkeit auf den New Yorker Bühnen erhielt Ruffalo anlässlich seiner Darstellung in der von der Kritik hoch gelobten off-Broadway-Produktion von "This Is Our Youth", geschrieben von Kenneth Lonergan, wofür er den Lucille Lortel Award als bester Schauspieler erhielt. Mark Ruffalo hatte aber auch Auftritte in über 30 Theaterstücken, so etwa in der off-Broadway-Produktion von "The Moment When", geschrieben von Pulitzer Preis- und Tony Award-Gewinner James Lapine. Zusätzlich zu seiner Schauspielerei war er Co-Autor und Regisseur des Stückes "Margaret" am Hudson Backstage Theatre in Los Angeles.
Zu Ruffalos weiteren Filmkredits gehören "Committed" mit Heather Graham, der auf dem Sundance Film Festival gezeigt wurde, Ang Lees "Ride With the Devil" (1999) und Mark Christophers "Studio 54" (1998). Darüber hinaus hatte Ruffalo Hauptrollen in einer Vielzahl von unabhängig produzierten Filmen wie Joan Micklin Silvers "A Fish In the Bathtub" (1998), "Life/Drawing" (1998) und "Die Safe-Spezialisten" (1998). Zusätzlich schrieb und spielte er in "The Destiny of Marty Fine", der erfolgreich 1995 auf dem Slamdance Film Festival gezeigt wurde.
Im Fernsehen spielte Ruffalo in Filmen wie "Am zweiten Weihnachtstag" (1997) an der Seite von Mary Stuart Masterson und in "Houdini - Flirt mit dem Tod". Ebenso sah man ihn in der Drama-Serie "The Beat" (2000), kreiert von Barry Levinson und Tom Fontana. 2001 sah man Mark Ruffalo in dem Knastdrama "Die letzte Festung" und in John Woos Zweiten Weltkriegs-Drama "Windtalkers". Außerdem stand er in "A View From The Top" mit Gwyneth Paltrow vor der Kamera und spielte in "XX/XY".
Einen privaten Schicksalsschlag musste Mark Ruffalo im Dezember 2008 verkraften: Sein zwei Jahre jüngerer Bruder Scott, ein in Los Angeles angesagter Friseur, wurde in der eigenen Wohnung in Beverly Hills mit schweren Verletzungen aufgefunden, die er durch einen Kopfschuss erlitten hatte. Tage später starb er an den Folgen der Verletzungen, kurz vor seinem Tod stellte sich eine 26-jährige Frau freiwillig der Polizei.
Weitere Filme mit Mark Ruffalo: "Devil Dance" (1993), The Last Days of Paradise" (1994), "The Dentist" (1996), "Blackmail - Blutige Abrechnung" (1996), "Studio 54" (1998), "Mein Leben ohne mich" (2002), "Flight Girls", "In the Cut" (beide 2003), "30 über Nacht", "Vergiss mein nicht!", "Collateral" (alle 2004), "Wo die Liebe hinfällt", "Solange du da bist" (2005), "Das Spiel der Macht" (2006), "Zodiac - Die Spur des Killers", "Ein einziger Augenblick" (beide 2007), "Die Stadt der Blinden", "Brothers Bloom" (beide 2008), "Wo die Wilden Kerle wohnen" (2009), "Shutter Island", "The Kids Are All Right" (beide 2010), "Marvel's The Avengers" (2012), "Die Unfassbaren - Now You See Me" (2013), "Foxcatcher" (2014), "Avengers 2: Age of Ultron" (2015).